Гидроксикоричные кислоты (ГКК) — один из видов синтезируемых растениями биологически активных соединений (БАС). По химическому строению они относятся к фенолам и являются представителями обширного класса фенилпропаноидов [1]. Спектр фармакологической активности большинства ГКК достаточно широк. Они проявляют антиоксидантное, антигипоксическое, противовоспалительное, антиаритмическое, противогрибковое, антимикробное, желчегонное, гепатопротекторное, антиаллергическое виды действия [1][2]. ГКК эффективно нейтрализуют свободные радикалы в организме и связывают ионы тяжелых металлов. Комбинация различных ГКК в лекарственных растениях обусловливает суммарный фармакологический эффект препаратов на их основе. Поиск новых источников лекарственного растительного сырья с высоким содержанием ГКК является на сегодняшний день актуальной задачей для медицины и фармации, что требует применения объективных и доступных методов качественного и количественного анализа этой группы соединений.

Для изучения ГКК в растительном сырье используют различные способы их извлечения и методики анализа [3]. Согласно требованиям Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV изд. для идентификации ГКК используются методы бумажной или тонкослойной хроматографии, а для количественного анализа — спектрофотометрический метод.

Цель работы — оценка возможности определения количественного содержания гидроксикоричных кислот в растительном сырье методом прямой спектрофотометрии.

Материалом для исследования являлись источники отечественной научной литературы (научные журналы и публикации научных конференций) информационно-поисковых (PubMed, Google Scholar) и библиотечных баз данных (eLIBRARY.RU, КиберЛенинка), а также приложения ResearchGate для семантического поиска за период 2007–2023 гг.

Количественный анализ ГКК методом спектрофотометрии с УФ-детектированием основан на их способности поглощать электромагнитное изучение в области 220–330 нм. Характеристики УФ-спектров ГКК в различных растворителях приведены в таблице 1. Анализ данных литературы за последние 15 лет показал, что большинство российских авторов применяют метод прямой спектрофотометрии для количественного определения суммы ГКК, используя как различные способы извлечений из растительного сырья, так и различные расчеты содержания ГКК в них.

Так, О.Л. Сайбель и соавт. с использованием метода прямой спектрофотометрии определили оптимальные сроки заготовки травы цикория обыкновенного (Cichorium intybus L.) [12]. Сумму фенольных соединений экстрагировали на кипящей водяной бане спиртом этиловым 50% при соотношении «сырье (г) : экстрагент (мл)» 1:100 в течение 60 мин с момента закипания растворителя. Содержание суммы фенольных соединений (4,3%) в пересчете на цикориевую кислоту вычисляли по величине оптической плотности раствора стандартного образца цикориевой кислоты.

А.В. Азнагуловой и В.А. Куркиным описана методика определения суммы полифенольных соединений в траве одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) с экстракцией спиртом этиловым 50% при нагревании на кипящей водяной бане в течение 2 ч. Согласно этой методике измеряют оптическую плотность извлечения при длине волны 330 нм и рассчитывают количественное содержание суммы полифенольных соединений в пересчете на хлорогеновую кислоту (7,0%) по величине удельного показателя поглощения А1%1см [13].

В работе Н.Ф. Гончарова [14] определена сумма ГКК в нефармакопейных видах рода боярышник (Crataegus) методом прямой спектрофотометрии после однократной экстракции на кипящей водяной бане спиртом этиловым 70% при соотношении «сырье (г) : экстрагент (мл)» 1:10. Содержание суммы ГКК в плодах в пересчете на хлорогеновую кислоту составило 0,17% для боярышника страшного (Crataegus horrida Medik), 0,18% для боярышника густоцветкового (C. densiflora Sarg), 0,20% для боярышника сочного (С. succulenta Schrad. ex Link), 0,15% для боярышника однопестичного (C. monogyna Jacq.) и 0,18% для боярышника волжского (С. volgensis Pojark.).

Приведенные примеры свидетельствуют о разных условиях извлечения (экстрагент, соотношение «сырье : экстрагент», кратность и время экстракции, температура) и выборе преобладающего соединения при расчете содержания суммы ГКК. В таблице 2 приведены данные литературы по количественному определению суммы ГКК (или суммы фенольных соединений) в анализируемом растительном сырье методом прямой спектрофотометрии, условия их экстракции и содержание в пересчете на преобладающую ГКК.

В качестве растительного сырья наиболее часто используют траву (около 50%), значительно реже — листья (около 30%) (в случае Hypericum perforatum L. — свежие листья). Очень редко сырьем служат корни, кора, плоды, стебли (15%) (табл. 2). Сравнительный анализ количественного содержания ГКК надземных (трава) и подземных органов (корни) в одном растении проведен только для Eryngium planum L. (1,69 и 0,42% соответственно) и Eryngium caucasicum Trautv. (1,72 и 0,07% соответственно). Эти данные наглядно показывают, что в траве содержится значительно большее количество ГКК по сравнению с корнями, за исключением ели обыкновенной, в корнях которой регистрируется высокое содержание ГКК [11].

Для получения извлечений из исследуемого растительного сырья в качестве экстрагента используют спирт этиловый в концентрации 30–96%. Наиболее часто применяется спирт этиловый 70%, что обусловлено лучшей растворимостью в нем полифенольных соединений, в том числе ГКК. В основном соотношение «сырье (г) : экстрагент (мл)» составляет 1:100 (55%), достаточно часто — 1:50 (28%), реже — 1:10; 1:20; 1:30 и 1:40, очень редко — 1:200. Такой разброс в соотношении «сырье (г) : экстрагент (мл)» обусловлен различным содержанием ГКК в анализируемых образцах растительного сырья (табл. 2).

Как правило, проводится однократная экстракция при нагревании на кипящей водяной бане в течение фиксированного времени при определенной температуре. В редких случаях применяют многократную (2–4-кратную) экстракцию. Например, в случае Helianthus annuus L. (листья), Lycopus europaeus L. (трава), Equisetum sylvaticum L. (трава) экстракцию проводят при температуре 60 °С, а для Sorbus aucuparia L. (плоды) — при 80 °С. Наибольшая длительность экстракции описана в работе Ю.В. Загурской и соавт. [25] — при пробоподготовке образцов свежих листьев Hypericum perforatum L. экстракцию проводили при комнатной температуре в течение 24 ч (табл. 2).

Следует отметить разные способы уточнения объема полученного извлечения. Так, при однократной экстракции травы одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) и сырья хондриллы ситниковидной (Chondrilla juncea L.) авторы восполняют потерю экстрагента в процессе извлечения, доводя массу экстрагентом до исходного значения, взвешивая колбу до и после экстракции [13][24]. Однако зачастую авторы предлагают доводить объем экстракта растворителем до метки после охлаждения полученного извлечения и фильтрования через бумажный фильтр в мерную колбу (см., например, [4][6][8][35]).

Количественное содержание суммы ГКК в анализируемом сырье рассчитывают в пересчете на преобладающую кислоту, которой наиболее часто является хлорогеновая кислота (около 44%) (табл. 2). Значительно реже в качестве маркера содержания суммы ГКК принимают розмариновую, феруловую, кофейную или цикориевую кислоты. При анализе травы и листьев Hamerion angustifolium (L.) Holub. сумму ГКК рассчитывали на транс-коричную кислоту. При использовании для анализа различных видов растительного сырья (листьев и травы; листьев и цветков; листьев и плодов; листьев и стеблей) содержание суммы ГКК в пересчете на преобладающую кислоту, как правило, было практически одинаковым [26][32]. Исключением являются трава и корни Eryngium planum L. и Erythronium caucasicum Trautv. — установлено, что сумма ГКК в траве была выше, чем в корнях, в 3 и 16 раз соответственно [38].

В качестве экстрагента ГКК, как правило, используется спирт этиловый, однако некоторые авторы показали возможность экстракции ГКК водой. Из листьев гинкго двулопастного (Ginkgo biloba L.) и яблони лесной (Malus sylvestris Mill.), травы астрагала вздутого (Astragalus physodes L.) и девясила британского (Inula britannica L.) ГКК двукратно экстрагировали водой при нагревании на кипящей водяной бане по 15 мин. Содержание суммы ГКК в сырье в пересчете на кофейную кислоту рассчитывали по величине А1%1см кофейной кислоты. Содержание ГКК составило в листьях Malus sylvestris Mill. 2,3% [64], листьях Ginkgo biloba L. — 0,29% [6], траве Inula britannica L. и Astragalus physodes L. — 5,16 и 0,57% соответственно [65][66]. Р.И. Лукашов установил, что экстракция из травы эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea (L.) Moench) 60% ацетоном увеличивает извлечение суммы ГКК в 2–3 раза по сравнению с экстракцией спиртом этиловым [67].

Резюмируя данные по использованию метода прямой спектрофотометрии для количественного определения ГКК в растительном сырье, следует отметить, что этот метод характеризуется высокой чувствительностью, но неселективен. Основным недостатком описанных спектрофотометрических методик является невозможность раздельно определять количественное содержание каждого из веществ или сумму группы веществ одного класса соединений, в том числе ГКК, кумаринов, флавоноидов и антрахинонов, при их совместном присутствии. Метод позволяет определять только общее содержание полифенольных соединений в пробе5.

В ряде работ авторы утверждают, что методом прямой спектрофотометрии можно определить не сумму ГКК, а сумму фенольных соединений в пересчете на конкретную ГКК (см., например, [18][20][25][29][38][54]). Согласно ФС.2.5.0084.18 Мелиссы лекарственной трава (Melissae officinalis herba) ГФ РФ XIV изд. методом прямой спектрофотометрии определяют сумму фенольных соединений в пересчете на розмариновую кислоту. В то же время другие авторы отмечают, что прямым спектрофотометрическим методом они находят сумму именно ГКК (см., например, [14][17][22][28][48][57][64][65]). Также, согласно требованиям ФС.2.5.0019.15 Крапивы двудомной листья (Urticae dioicaе folia) ГФ РФ XIV изд., методом прямой спектрофотометрии проводится определение суммы оксикоричных кислот. Можно согласиться с теми авторами, которые критично подходят к полученным результатам и отмечают, что метод дает завышенные результаты и может быть использован только для определения суммы фенольных соединений6.

Для количественного определения полифенольных соединений, в том числе и ГКК, в растениях, произрастающих или культивируемых на территории Российской Федерации, широко используется метод прямой спектрофотометрии. Объектами исследования в основном является надземная часть растений (трава, листья, цветки, побеги, плоды и т.д.), значительно реже — корни и корневища с корнями.

Выбор условий извлечения ГКК из РС (экстрагент, соотношение «сырье : экстрагент», кратность и длительность экстракции, температура), как правило, обусловлен составом биологически активных соединений. Установлено, что ГКК из растительного сырья извлекают в основном спиртом этиловым различной концентрации при одно-трехкратной экстракции путем настаивания растительного сырья с экстрагентом при комнатной температуре или на кипящей водяной бане. Количественное содержание суммы ГКК пересчитывают на преобладающую кислоту по градуировочному графику, оптической плотности стандартного образца, а также используя удельный показатель поглощения.

Использование метода прямой спектрофотометрии обусловлено его достаточной простотой, высокой воспроизводимостью, отсутствием трудоемких операций и необходимости использования дополнительных реактивов. Однако, если растительное сырье содержит другие фенольные соединения, которые могут поглощать в аналитической области спектра поглощения преобладающих ГКК и суммируются с поглощением ГКК, метод дает завышенные результаты, не соответствующие истинному содержанию ГКК.

Таким образом, метод прямой спектрофотометрии можно рассматривать только как метод количественного определения суммы фенольных соединений (в том числе и суммы ГКК) в растительном сырье.

Проведенный анализ публикаций российских авторов по использованию метода прямой спектрофотометрии для количественного определения ГКК в растениях, произрастающих и культивируемых на территории Российской Федерации, может служить методологической основой разработки методик анализа в зависимости от химического состава БАС, содержащихся в растительном сырье и извлечениях из них.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям ICMJE. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.В. Компанцева — существенный вклад в концепцию статьи; сбор, анализ научных публикаций; А.Ю. Айрапетова — сбор, анализ научных публикаций, редактирование текста рукописи; А.С. Саушкина — написание текста рукописи и критический пересмотр его содержания.

Authors’ contributions. All authors confirm that their authorship meets the ICMJE criteria. The most significant contributions were as follows. Evgenia V. Kompantseva made a substantial contribution to the concept of the article; collected and analysed research publications. Asya Yu. Ayrapetova collected and analysed research publications, edited the manuscript. Anna S. Saushkina drafted and critically revised the manuscript.

1. Вельмяйкина ЕИ. Фармакогностическое исследование эхинацеи пурпурной как источника иммуномодулирующих лекарственных средств: автореф. дис. … канд. фарм. наук. Самара; 2013. 2. Там же 3. Преловская СЗ. Фармакогностическая характеристика Artemisia subviscosa Turcz. ex Bess. и Artemisia santolinifolia Turcz. ex Bess. и разработка лекарственных средств на их основе: автореф. дис. … канд. фарм. наук. Улан-Удэ; 2020. 4. Там же. 5. Старчак ЮА. Фармакогностическое изучение растений рода Тимьян (Thymus L.) как перспективного источника получения фитопрепаратов: дис. … д-ра фарм. наук. Самара; 2016. Давитавян НА. Разработка технологии и нормирование качества жидкого и сухого экстрактов травы стальника полевого: автореферат дис. … канд. фармацевт. наук. Пятигорск; 2007. 6. Старчак ЮА. Фармакогностическое изучение растений рода Тимьян (Thymus L.) как перспективного источника получения фитопрепаратов: дис. … д-ра фарм. наук. Самара; 2016.