Рощина Марина Владимировна, канд. фарм. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Marina V. Roshchina, Cand. Sci. (Pharm.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
Сахно Надежда Геннадьевна, канд. фарм. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Nadezhda G. Sakhno, Cand. Sci. (Pharm.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
Гунар Ольга Викторовна, д-р фарм. наук
Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051
Olga V. Gunar, Dr. Sci. (Pharm.)
8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051
ВВЕДЕНИЕ. Контроль стерильности высокотехнологичных лекарственных препаратов (ВТЛП) осложнен рядом факторов, в том числе: ограничением объема доступной пробы, чувствительностью препаратов к условиям тестирования, ограничением срока хранения препаратов. Контроль классическими фармакопейными методами зачастую не позволяет своевременно и достоверно подтвердить стерильность ВТЛП, что снижает доступность препаратов для пациентов и возможность быстрого проведения необходимой терапии. Повысить скорость и эффективность проведения контроля стерильности можно путем разработки альтернативных ускоренных микробиологических методик, учитывающих специфику ВТЛП.
ЦЕЛЬ. Оптимизация методики контроля стерильности высокотехнологичных лекарственных препаратов методом колориметрического определения углекислого газа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Объект исследования — образец высокотехнологичного лекарственного генотерапевтического препарата. Используемые тест-штаммы: Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATСС 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Clostridium sporogenes ATCC 19404, Cutibacterium acnes (Propionibacterium acnes) NCTC 737, Candida albicans АТСС 10231, Aspergillus brasiliensis АТСС 16404, Aspergillus fumigatus ВКПМ F-62, Aspergillus terreus ВКПМ F-1269, Penicillium chrysogenum ВКПМ F-3. Питательные среды: SA, SN и iLYM для прибора BacT/ALERT 3D Dual T — флаконы с модифицированными средами на основе триптиказо-соевого бульона; триптиказо-соевый бульон (TSB) и жидкая тиогликолевая среда (FTM) — пробирки с фармакопейными питательными средами, предусмотренными для проведения испытания по показателю «Стерильность» методом прямого посева. Оборудование: ламинарный шкаф Purifier Logic A2, система BacT/ALERT 3D Dual T с автоматическим мониторингом и детекцией контаминированных флаконов и построением кривых роста микроорганизмов. Контаминированные образцы ВТЛП готовили с теоретической концентрацией тест-штаммов 3 КОЕ/мл. Посев осуществляли в объемах 0,1; 0,5 и 1,0 мл в двадцатикратной повторности в пробирки и флаконы с соответствующими питательными средами. Использовали как фармакопейные среды (TSB, FTM), так и модифицированные, предназначенные для системы BacT/ALERT (SA, SN, iLYM). Инкубацию при прямом посеве проводили в течение 14 сут; анализ в системе BacT/ALERT длился 7 сут при непрерывном автоматическом мониторинге при температурах 32,5±2,5 и 22,5±2,5 °С для бактерий и грибов соответственно. Результаты учитывали визуально (прямой посев) и по кривым роста содержания CO2 (альтернативный метод).
РЕЗУЛЬТАТЫ. В ходе исследования установлено, что чувствительность BacT/ALERT 3D Dual T при анализе проб объемом 0,5 мл составила ≥80% для аэробных и анаэробных бактерий, а также ≥90% для дрожжевых и плесневых грибов при использовании модифицированной среды iLYM с предварительной аэрацией. В условиях прямого посева тот же уровень выявления требовал не менее 1,0 мл пробы. Сроки выявления контаминации с использованием BacT/ALERT были на 0,38–2,4 сут меньше, чем при фармакопейной методике прямого посева, при сохранении полноты обнаружения всех тест-штаммов, за исключением Candida albicans, время детектирования которого одинаково при использовании обеих методик. Частота получения ложноотрицательных результатов при выявлении плесневых грибов на среде SA достигала 13–70% в зависимости от штамма. Введение этапа кратковременной аэрации (5–7 с) при использовании среды iLYM снижало частоту ложноотрицательных результатов до 0–3%. Все тестируемые микроорганизмы, кроме Cutibacterium acnes, были полностью детектированы в течение ≤ 28 ч; для C. acnes время инкубации составило около 134 ч.
ВЫВОДЫ. Альтернативный метод BacT/ALERT 3D Dual T превосходит традиционную фармакопейную методику по чувствительности, воспроизводимости и скорости анализа. Ложноотрицательные результаты при выявлении плесневых грибов на среде SA достигали 70%, но показана возможность их практически полного устранения при использовании аэрированной среды iLYM. Полный спектр тест-микроорганизмов достоверно выявляется за 7 сут обеими методиками, при этом время обнаружения контаминации с использованием альтернативной методики снижается на 0,38–2,4 сут. Объем пробы 0,5 мл в системе BacT/ALERT обеспечивает эффективное выявление контаминантов, что вдвое снижает расход ВТЛП по сравнению с фармакопейным методом (1,0 мл).
INTRODUCTION. Sterility testing of advanced therapy medicinal products (ATMP) implies several challenges, including limited volume of available sample, product sensitivity to test conditions, and short shelf life. Classical pharmacopoeial test methods often fail to confirm sterility in a timely and reliable manner. The resulting drug availability for patients is reduced, as well as the opportunity for fast treatment with high-quality medicines. Faster alternative microbiological methods that reflect ATMP specificity of advanced therapy medicinal products can speed up and enhance sterility control.
AIM. This study aimed to optimise ATMP sterility control using colorimetric carbon dioxide detection.
MATERIALS AND METHODS. We used an experimental sample of an ATMP as the test object. We challenged the system with the following test strains: Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Clostridium sporogenes ATCC 19404, Cutibacterium acnes (Propionibacterium acnes) NCTC 737, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Aspergillus fumigatus VKPM F-62, Aspergillus terreus VKPM F-1269, Penicillium chrysogenum VKPM F-3. We used SA, SN, and iLYM bottles with pharmacopoeial growth media: modified tryptic soy broth for the BacT/ALERT 3D Dual T system, tryptic soy broth, and fluid thioglycollate medium in test tubes designed for sterility testing using direct inoculation. All manipulations took place in a Purifier Logic A2 laminar flow cabinet, with BacT/ALERT 3D Dual T system to automatically monitor cultures, detect contamination, and record microbial growth curves. We prepared artificially contaminated samples by adding 3 CFU/mL of each test strain. We inoculated 0.1, 0.5, and 1.0 mL sample volumes into appropriate media, performing 20 replicates for each condition. Growth media included both pharmacopoeial (tryptic soy broth, fluid thioglycollate) ones and modified media for BacT/ALERT (SA, SN, iLYM). We incubated the direct inoculation samples for 14 days. In the BacT/ALERT system, we ran a 7-day incubation with continuous monitoring at 32.5±2.5 °C for bacteria and 22.5±2.5 °C for fungi. We evaluated direct inoculation results visually and assessed BacT/ALERT results based on CO2 growth curves (alternative method).
RESULTS. The BacT/ALERT 3D Dual T system detected ≥80% of aerobic and anaerobic bacteria and ≥90 % of yeasts and molds at 0.5 mL sample volume using pre-aerated iLYM medium. In contrast, direct inoculation required 1.0 mL to reach similar detection levels. BacT/ALERT reduced the time to contamination detection by 0.38–2.4 days compared to direct inoculation, while identifying all test strains except Candida albicans that showed similar detectability in both methods. When using SA medium, false-negative results for molds made 13–70 % of cases, depending on the strain. Short-time iLYM aerating for 5–7 s before incubation reduced false negatives to 0–3 %. We successfully detected all tested microorganisms within 28 h, except for Cutibacterium acnes, which required up to 134 h.
CONCLUSIONS. The BacT/ALERT 3D Dual T system delivers higher sensitivity, reproducibility, and faster detection compared to traditional pharmacopoeial methods. False negative results for mold fungi in SA medium were as high as 70%. However, they can be significantly reduced using aerated iLYM medium. Both methods reliably detect all test organisms within 7 days, but alternative BacT/ALERT achieves detection 0.38–2.4 days sooner. Using a 0.5 mL sample volume with BacT/ALERT effectively detects contamination and reduces product use by half compared to pharmacopoeial testing (1.0 mL).
The authors declare that there are no conflicts of interest present.