vedomostiregmedРегуляторные исследования и экспертиза лекарственных средствRegulatory Research and Medicine Evaluation3034-30623034-3453Federal State Budgetary Institution ‘Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products’ of the Ministry of Health of the Russian Federation (FSBI ‘SCEEMP’)10.30895/1991-2919-2025-15-3-330-346vedomostiregmed-759Research ArticleРАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКDEVELOPMENT AND VALIDATION OF RESEARCH METHODSМоноклональные антитела: разработка платформенных методик оценки примесей высокомолекулярных и низкомолекулярных соединенийMonoclonal antibodies: Development of universal (platform) methods for the assessment of high and low-molecular weight impuritieshttps://orcid.org/0000-0003-2904-7382ВагановаО. А.VaganovaO. A.

Ваганова Ольга Александровна, канд. фарм. наук 

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация

Olga A. Vaganova, Cand. Sci. (Pharm.)

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation

vaganova@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8593-1944СмирновР. С.SmirnovR. S.

Смирнов Роман Сергеевич, канд. хим. наук

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация

Roman S. Smirnov, Cand. Sci. (Chem.)

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation

https://orcid.org/0009-0006-9808-5760ЛенинС. А.LeninS. A.

Ленин Сергей Андреевич

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация

Sergei A. Lenin

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation

https://orcid.org/0009-0006-6074-3318ФунташевК. С.FuntashevK. S.

Фунташев Кирилл Сергеевич

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация

Kirill S. Funtashev

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-5588-5801КостромскихА. А.KostromskihA. A.

Костромских Анастасия Андреевна, канд. хим. наук 

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация

Anastasia A. Kostromskih, Cand. Sci. (Chem.)

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0001-8187-1008ПерегудоваА. С.PeregudovaA. S.

Перегудова Александра Сергеевна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация

Aleksandra S. Peregudova

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation

https://orcid.org/0009-0007-9087-0630КадыковаД. А.KadykovaD. A.

Кадыкова Дарья Алексеевна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация

Darya A. Kadykova

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation

https://orcid.org/0000-0003-4891-973XМеркуловВ. А.MerkulovV. A.

Меркулов Вадим Анатольевич, д-р мед. наук, проф.

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051, Российская Федерация

Vadim A. Merkulov, Dr. Sci. (Med.), Professor

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051, Russian Federation

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияScientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal ProductsRussian Federation202502072025153330346Copyright © Ваганова О.А., Смирнов Р.С., Ленин С.А., Фунташев К.С., Костромских А.А., Перегудова А.С., Кадыкова Д.А., Меркулов В.А., 20252025Ваганова О.А., Смирнов Р.С., Ленин С.А., Фунташев К.С., Костромских А.А., Перегудова А.С., Кадыкова Д.А., Меркулов В.А.Vaganova O.A., Smirnov R.S., Lenin S.A., Funtashev K.S., Kostromskih A.A., Peregudova A.S., Kadykova D.A., Merkulov V.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.vedomostincesmp.ru/jour/article/view/759ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. Разработка унифицированных методик контроля качества лекарственных средств на основе моноклональных антител (МАТ) является одной из задач стандартизации МАТ.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Разработка и анализ возможности применения платформенных (универсальных) методик для оценки содержания примесей высокомолекулярных соединений и фрагментов, негликозилированных молекул в различных МАТ методами эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Лекарственные препараты, содержащие МАТ, 28 различных международных непатентованных наименований российского и иностранного производства. Исследования методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЭХ) проводили на приборах Agilent Technologies серии 1200, оснащенных детекторами поглощения в УФ-области. Обработку и анализ хроматограмм осуществляли с помощью программного обеспечения OpenLab. Капиллярный гель-электрофорез (КГЭ) проводили в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием системы PA 800 plus (Beckman Coulter), оснащенной диодно-матричным детектором с поглощением в УФ-области и программным обеспечением Beckman 32Karat.

РЕЗУЛЬТАТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ. Подобраны универсальные условия пробоподготовки, хроматографического и электрофоретического разделения и определения содержания целевых соединений в препаратах МАТ, методики апробированы на 28 МАТ. Для каждого МАТ определены времена удерживания и времена миграции пиков целевых соединений. Проведено сравнение данных, полученных по разработанным методикам и по оригинальным методикам производителей МАТ. Проведена валидация методик определения содержания в образцах МАТ высокомолекулярных соединений методом ЭХ, фрагментов МАТ и негликозилированных молекул тяжелых цепей МАТ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях методом КГЭ. Правильность, воспроизводимость и чувствительность методик соответствуют установленным требованиям. Полученные результаты оценки валидационных 

характеристик методики ЭХ: прецизионность (RSD) площадей пиков составила для мономера не более 0,4%, для групп агрегатов до 8%, для общей площади пиков не более 0,4%, для относительной площади пика, соответствующего мономеру, — 0,02%. Линейность методики подтверждена в диапазоне концентраций 0,5–120%, правильность — в линейном диапазоне 99,1–102,1%, предел количественного определения (ПКО) — 0,1%. Валидационные характеристики методики КГЭ: прецизионность не более 1% для содержания основного пика иммуноглобулина или суммы пиков тяжелых и легких цепей и не более 1% для абсолютных времен миграции основных пиков. Линейность методик подтверждена в диапазоне концентраций от ПКО до 300%. Правильность для обеих методик составила 97,6–103,7%, ПКО — 0,5 и 0,75% соответственно.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. Разработанные методики оценки чистоты препаратов МАТ являются универсальными для неконъюгированных МАТ; по валидационным характеристикам специфичности, прецизионности, предела количественного определения, аналитической области, линейности, правильности соответствуют установленным критериям приемлемости и могут применяться на любом этапе жизненного цикла препаратов указанной группы.

INTRODUCTION

INTRODUCTION. The development of unified techniques for quality control monoclonal antibodies (mAb) is one of the challenges for mAbs quality standardization.

AIM

AIM. This study aimed to develop and analyse the possibility of using platform (universal) techniques for estimating the impurity content of high molecular weight compounds and fragments, non-glycosylated molecules in various mAbs by methods of size-exclusion high performance liquid chromatography (SE-HPLC) and capillary electrophoresis methods.

MATERIALS AND METHODS

MATERIALS AND METHODS. MAbs-containing medicinal products from 28 different international nonproprietary names of Russian and foreign origin. Studies by SE-HPLC were carried out on Agilent Technologies 1200 series instruments equipped with UV detectors, with data processed via OpenLab software. Capillary gel electrophoresis (CGE) was conducted under both reducing and non-reducing conditions using a PA 800 plus system (Beckman Coulter) with UV diode array detection, and Beckman 32Karat software.

RESULTS

RESULTS. Universal sample preparation protocols and separation conditions were established and validated across 28 mAbs. Retention times and relative migration times of target compounds peaks were determined for each mAb. Comparative analysis demonstrated concordance between platform methods and manufacturers' proprietary methods. Validation of methods for determination of the content of high-molecular weight compounds in mAbs samples by the SE-HPLC method, fragments of mAbs and non-glycosylated variants of heavy chains of mAbs under reducing and non-reducing conditions by the CGE method was performed. The accuracy, precision, and sensitivity of the methods met the established requirements. The validation characteristics obtained for the SE-HPLC method were as follows: precision (RSD) of peak areas was no more than 0.4% for the monomer, up to 8% for aggregate groups, no more than 0.4% for total peak areas, and 0.02% for the relative peak area corresponding to the monomer. The method's linearity was confirmed within the concentration range of 0.5–120%, accuracy within 99.1–102.1%, and the limit of quantification (LOQ) was 0.1%. For the CGE method, the validation characteristics showed precision of no more than 1% for intact immunoglobulin content or heavy and light chain peaks, and no more than 1% for absolute migration times of main peaks. Linearity was confirmed from LOQ to 300% concentration range. The accuracy for both methods ranged from 97.6–103.7%, with LOQ values of 0.5% and 0.75%, respectively.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. The developed methods for assessing the purity are universal for unconjugated mAbs products. Their validation characteristics — including specificity, precision, limit of quantification, analytical range, linearity, and accuracy — meet all established acceptance criteria. These methods can be reliably implemented at any stage of the product lifecycle for this category of medicinal products.

моноклональное антителокапиллярный электрофорезэксклюзионная хроматографиякачество лекарственных средствнормативный документвысокоэффективная жидкостная хроматографияплатформенная методикауниверсальная методикавалидациячистотаmonoclonal antibodyМАВcapillary electrophoresissize exclusion chromatographyquality of medicinesnormative documenthigh performance liquid chromatographyplatform techniqueuniversal techniqueРабота выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00001-25-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР № 124022200093-9).This study was conducted by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products as part of the applied research funded under State Assignment No. 056-00001-25-00 (R&D Registry No. 124022200093-9).ReferencesLu RM, Hwang YC, Liu IJ, Lee CC, Tsai HZ, Li HJ, et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. J Biomed Sci. 2020;27(1):1. https://doi.org/10.1186/s12929-019-0592-zLu RM, Hwang YC, Liu IJ, Lee CC, Tsai HZ, Li HJ, et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. J Biomed Sci. 2020;27(1):1. https://doi.org/10.1186/s12929-019-0592-zCarrara SC, Ulitzka M, Grzeschik J, Kornmann H, Hock B, Kolmar H. From cell line development to the formulated drug product: The art of manufacturing therapeutic monoclonal antibodies. Int J Pharm. 2021;594:120164. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.120164Carrara SC, Ulitzka M, Grzeschik J, Kornmann H, Hock B, Kolmar H. From cell line development to the formulated drug product: The art of manufacturing therapeutic monoclonal antibodies. Int J Pharm. 2021;594:120164. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.120164Mou X, Yang X, Li H, Ambrogelly A, Pollard D. A high throughput ultra performance size exclusion chromatography assay for the analysis of aggregates and fragments of monoclonal antibodies. Pharm Bioprocess. 2014;2(2):141–56.Mou X, Yang X, Li H, Ambrogelly A, Pollard D. A high throughput ultra performance size exclusion chromatography assay for the analysis of aggregates and fragments of monoclonal antibodies. Pharm Bioprocess. 2014;2(2):141–56.Hernández-Jiménez J, Martínez-Ortega A, Salmerón-García A, Cabeza J, Prados JC, Ortíz R, et al. Study of aggregation in therapeutic monoclonal antibodies subjected to stress and long-term stability tests by analyzing size exclusion liquid chromatographic profiles. Int J Biol Macromol. 2018;118(A):511–24. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.06.105Hernández-Jiménez J, Martínez-Ortega A, Salmerón-García A, Cabeza J, Prados JC, Ortíz R, et al. Study of aggregation in therapeutic monoclonal antibodies subjected to stress and long-term stability tests by analyzing size exclusion liquid chromatographic profiles. Int J Biol Macromol. 2018;118(A):511–24. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2018.06.105Kumar R, Guttman A, Rathore AS. Applications of capillary electrophoresis for biopharmaceutical product characterization. Electrophoresis. 2022;43(1–2):143–66. https://doi.org/10.1002/elps.202100182Kumar R, Guttman A, Rathore AS. Applications of capillary electrophoresis for biopharmaceutical product characterization. Electrophoresis. 2022;43(1–2):143–66. https://doi.org/10.1002/elps.202100182Zhang J, Burman S, Gunturi S, Foley JP. Method development and validation of capillary sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis for the characterization of a monoclonal antibody. J Pharm Biomed Anal. 2010;53(5):1236–43. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2010.07.029Zhang J, Burman S, Gunturi S, Foley JP. Method development and validation of capillary sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis for the characterization of a monoclonal antibody. J Pharm Biomed Anal. 2010;53(5):1236–43. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2010.07.029Kaur H, Beckman J, Zhang Y, Jian Li Z, Szigeti M, Guttman A. Capillary electrophoresis and the biopharmaceutical industry: Therapeutic protein analysis and characterization. TrAC Trend Anal Chem. 2021;144:116407. https://doi.org/10.1016/j.trac.2021.116407Kaur H, Beckman J, Zhang Y, Jian Li Z, Szigeti M, Guttman A. Capillary electrophoresis and the biopharmaceutical industry: Therapeutic protein analysis and characterization. TrAC Trend Anal Chem. 2021;144:116407. https://doi.org/10.1016/j.trac.2021.116407Szabo M, Sarkozy D, Szigeti M, Farsang R, Kardos Z, Kozma A, et al. Introduction of a capillary gel electrophoresis-based workflow for biotherapeutics characterization: Size, charge, and N-Glycosylation variant analysis of bamlanivimab, an anti-SARS-CoV-2 product. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:839374. https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.839374Szabo M, Sarkozy D, Szigeti M, Farsang R, Kardos Z, Kozma A, et al. Introduction of a capillary gel electrophoresis-based workflow for biotherapeutics characterization: Size, charge, and N-Glycosylation variant analysis of bamlanivimab, an anti-SARS-CoV-2 product. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:839374. https://doi.org/10.3389/fbioe.2022.839374Rauniyar N. Characterization of product related variants in therapeutic monoclonal antibodies. LCGC Int. 2024;1(6). https://doi.org/10.56530/lcgc.int.ap3874j8Rauniyar N. Characterization of product related variants in therapeutic monoclonal antibodies. LCGC Int. 2024;1(6). https://doi.org/10.56530/lcgc.int.ap3874j8Dadouch M, Ladner Y, Perrin C. Analysis of monoclonal antibodies by capillary electrophoresis: Sample preparation, separation and detection. Separations. 2021;8(1):4. https://doi.org/10.3390/separations8010004Dadouch M, Ladner Y, Perrin C. Analysis of monoclonal antibodies by capillary electrophoresis: Sample preparation, separation and detection. Separations. 2021;8(1):4. https://doi.org/10.3390/separations8010004Li M, Yu C, Wang W, Wu G, Wang L. Interlaboratory method validation of capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate (CE-SDS) methodology for analysis of mAbs. Electrophoresis. 2021;42(19):1900–13. https://doi.org/10.1002/elps.202170122Li M, Yu C, Wang W, Wu G, Wang L. Interlaboratory method validation of capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate (CE-SDS) methodology for analysis of mAbs. Electrophoresis. 2021;42(19):1900–13. https://doi.org/10.1002/elps.202170122Alhazmi HA, Albratty M. Analytical techniques for the characterization and quantification of monoclonal antibodies. Pharmaceuticals. 2023;16(2):291. https://doi.org/10.3390/ph16020291Alhazmi HA, Albratty M. Analytical techniques for the characterization and quantification of monoclonal antibodies. Pharmaceuticals. 2023;16(2):291. https://doi.org/10.3390/ph16020291

The authors declare that there are no conflicts of interest present.