vedomostiregmedРегуляторные исследования и экспертиза лекарственных средствRegulatory Research and Medicine Evaluation3034-30623034-3453Federal State Budgetary Institution ‘Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products’ of the Ministry of Health of the Russian Federation (FSBI ‘SCEEMP’)10.30895/1991-2919-2025-15-3-347-356vedomostiregmed-753Research ArticleРАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКDEVELOPMENT AND VALIDATION OF RESEARCH METHODSМетод определения пирогенности с использованием моноцитов: перспективы и особенности применения (обзор)Method for Determining Pyrogenicity Using Monocytes: Prospects and Features of Application (Review)https://orcid.org/0000-0002-6728-594XЧечетоваЕ. О.ChechetovaE. O.

Чечетова Екатерина Олеговна

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Ekaterina O. Chechetova

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051 

stepanuk@exmed.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8615-952XНеугодоваН. П.NeugodovaN. P.

Неугодова Наталия Петровна, канд. биол. наук

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Natalia P. Neugodova, Cand. Sci. (Biol.)

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051 

neugodova@expmed.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0305-7769ШаповаловаО. В.ShapovalovaO. V.

Шаповалова Ольга Владимировна, канд. фарм. наук

Петровский б-р, д. 8, стр. 2, Москва, 127051

Olga V. Shapovalova, Cand. Sci. (Pharm.)

8/2 Petrovsky Blvd, Moscow 127051 

shapovalova@expmed.ruФедеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияScientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal ProductsRussian Federation202502072025153347356Copyright © Чечетова Е.О., Неугодова Н.П., Шаповалова О.В., 20252025Чечетова Е.О., Неугодова Н.П., Шаповалова О.В.Chechetova E.O., Neugodova N.P., Shapovalova O.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.vedomostincesmp.ru/jour/article/view/753ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. Отсутствие пирогенных загрязнений относится к критическим показателям качества лекарственных средств, гарантирующим сохранение жизни и здоровья пациентов. С целью контроля подобных веществ в середине ХХ века в практику был внедрен биологический показатель «Пирогенность», в основе которого лежит оценка реакции кроликов на введение испытуемого образца. Следуя концепции 3R в 2009 г. в Европейскую фармакопею помимо испытания на кроликах включена монография альтернативного метода in vitro — тест активации моноцитов. В отечественную фармакопею данный тест включен в 2018 г. (ОФС.1.2.4.0016.18 «Тест активации моноцитов»). Однако на сегодняшний день метод не получил широкого применения среди производителей ни в России, ни за рубежом ввиду особенностей проведения теста, связанных с потребностью значительного количества человеческой крови для получения моноцитов, с ограниченным выбором наборов реактивов и др. Испытание «Пирогенность» по-прежнему остается востребованным в области определения пирогенных примесей любой природы (бактериальных эндотоксинов и неэндотоксиновых пирогенов). Для более полной гармонизации с европейскими требованиями, реализации концепции 3R, связанной с гуманным отношением к животным, внедрение теста активации моноцитов является одной из приоритетных задач развития системы контроля качества лекарственных средств.

ЦЕЛЬ

ЦЕЛЬ. Оценка возможности применения теста активации моноцитов в качестве основного для определения неэндотоксиновых пирогенов.

ОБСУЖДЕНИЕ

ОБСУЖДЕНИЕ. В статье описаны фармакопейные методы определения пирогенных веществ, детально проанализирован метод определения пирогенов с использованием клеток крови человека — моноцитов. В настоящее время испытание на активацию моноцитов — единственный тест in vitro, позволяющий определять наличие пирогенов любой природы (бактериальные эндотоксины и пирогены неэндотоксиновой природы). Тест является достойным примером реализации стратегии замены испытаний на животных, позволяет определять примеси в случаях, когда контроль с помощью иных методик вызывает сложности или его невозможно выполнить. Главным недостатком, который затрудняет внедрение теста в рутинный контроль, является ограниченная доступность человеческой крови в качестве источника моноцитов. Обсуждены возможные источники моноцитов, которые могут быть применены при определении пирогенности, в том числе клетки крови животных. В соответствии с тенденцией к замене испытания in vivo — «Пирогенность» на альтернативный метод in vitro показана необходимость освоения применения метода при контроле качества биологических и иммунобиологических лекарственных средств.

ВЫВОДЫ

ВЫВОДЫ. По итогам проведенного теоретического анализа возможности применения метода in vitro в качестве основного для определения в первую очередь неэндотоксиновых пирогенов установлено, что мировое сообщество серьезно настроено на отказ от использования животных. Тест активации моноцитов включен в большинство фармакопей мира, а также в отечественную фармакопею, и рекомендован для выполнения в качестве основного контроля содержания пирогенов в лекарственных средствах.

INTRODUCTION

INTRODUCTION. Determination of pyrogenic contaminants in medicines is a critical quality indicator that guarantees the preservation of life and health of patients. In order to control such substances, the biological indicator "Pyrogenicity" was introduced in the middle of the 20th century, which is based on the assessment of the reaction of rabbits to the introduction of the test sample. In accordance with the 3R concept, since 2009, in addition to testing on rabbits, the European Pharmacopoeia has included a monograph of an alternative in vitro method - the Monocyte Activation Test. This test was included in the domestic pharmacopoeia in 2018 (OFS.1.2.4.0016.18 "Monocyte Activation Test"). However, to date, the method has not received wide application among manufacturers either in Russia or abroad due to the peculiarities of the test, related to the need for a significant amount of human blood to obtain monocytes, with a limited choice of reagent kits, etc. The "Pyrogenicity" test is still in demand in the field of determining pyrogenic impurities of any nature (bacterial endotoxins and non-endotoxin pyrogens). For more complete harmonization with European requirements, implementation of the 3R concept related to humane treatment of animals, the introduction of the monocyte activation test is one of the priority tasks.

AIM

AIM. Evaluation of the possibility of using the monocyte activation test as a primary test for the determination of non-endotoxin pyrogens.

DISCUSSION

DISCUSSION. The article describes pharmacopoeial methods for determining pyrogenic substances, analyzes in detail the method for determining pyrogens using human blood cells – monocytes. Currently, the monocyte activation test is the only in vitro test that allows determining the presence of pyrogens of any nature (bacterial endotoxins and non-endotoxin pyrogens). The test is a worthy example of implementing the strategy of replacing animal tests, it allows determining impurities in cases where control using other methods causes difficulties or cannot be performed. The main disadvantage that complicates the implementation of the test in routine control is the limited availability of human blood as a source of monocytes. Possible sources of monocytes that can be used to determine pyrogenicity, including animal blood cells, are discussed. In accordance with the trend to replace the in vivo test – "Pyrogenicity" with an alternative in vitro method, the need to master the application of the method in relation to biological and immunobiological medicinal products is shown.

CONCLUSIONS

CONCLUSIONS. Based on the results of the theoretical analysis of the possibility of using the in vitro method as the main method for determining, first of all, non-endotoxin pyrogens, it was established that the world community is seriously determined to refuse the use of animals. The monocyte activation test is included in most pharmacopoeias of the world, as well as in the domestic pharmacopoeia, and is recommended for implementation as the main control.

пирогенностьпирогенбактериальные эндотоксиныпирогены неэндотоксиновой природыальтернативные методытест активации моноцитовклетки крови человекапринцип 3Rлекарственные средстваиммунобиологические препаратыpyrogenicitypyrogenendotoxinsnon-endotoxin pyrogensmonocyte activation testmonocyteshuman blood cells3R principlemedicinal productsimmunobiological preparationsin vitroКоллектив авторов благодарит А.А. Тутнову за ценные консультации и возможность практической работы. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00001-25-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 124022200096-0).This study was conducted by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products as part of the applied research funded under State Assignment No. 056-00001-25-00 (R&D Registry No. 124022200096-0).ReferencesБагирова ВЛ, Митькин ОД, Митькина ЛИ. Тест на активацию моноцитов как альтернатива тесту «пирогенность» на кроликах. Фармация. 2010;(7):40–1.Багирова ВЛ, Митькин ОД, Митькина ЛИ. Тест на активацию моноцитов как альтернатива тесту «пирогенность» на кроликах. Фармация. 2010;(7):40–1.Moreillon P, Majcherczyk PA. Proinflammatory activity of cell-wall constituents from gram-positive bacteria. Scand J Infect Dis. 2003;35(9):632–41. https://doi.org/10.1080/00365540310016259Bagirova VL, Mitkin OD, Mitkina LI. The monocyte activation test as an alternative to the rabbit pyrogen test. Pharmacy. 2010;(7):40–1 (In Russ.). EDN: LTMHRWНеугодова НП, Рябцева МС, Сапожникова ГА. Основные требования к биологическим показателям при оценке качества лекарственных средств. Возможности валидации биологических методов контроля. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2016;(3):3–8.Moreillon P, Majcherczyk PA. Proinflammatory activity of cell-wall constituents from gram-positive bacteria. Scand J Infect Dis. 2003;35(9):632–41. https://doi.org/10.1080/00365540310016259Ситников АГ, Долгова ГВ, Неугодова НП. Анализ «Бактериальные эндотоксины» в отечественной нормативной документации. Бюллетень ЛАЛ-тест. 2008;(1):1–3.Neugodova NP, Ryabtseva MS, Sapozhnikova GA Basic requirements for biological criteria in drug quality evaluation. validation of biological control methods. Bulletin of the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products. 2016;(3):3–8 (In Russ.). EDN: WKNSQZСитников АГ, Неугодова НП, Долгова ГВ, Йорданова-Пашевич А. ЛАЛ-тест в России – итоги пяти лет внедрения метода в практику фармацевтического производства. Бюллетень ЛАЛ-тест. 2002;(1):1–8.Sitnikov AG, Dolgova GV, Neugodova NP. Analysis of “Bacterial endotoxins” in domestic regulatory documentation. LAL-test Bulletin. 2008(1):1–3.Hartung T, Wendel A. Detection of Pyrogens using human whole blood. ALTEX. 1995;12(2):70–5. PMID: 11178418.Sitnikov AG, Neugodova NP, Dolgova GV, Yordanova-Pashevich A. LAL-test in Russia – results of five years of introduction of the method into pharmaceutical production practice. LAL-test Bulletin. 2002;(1):1–8.Wunderlich C, Schumacher S, Kietzmann M. Pyrogen detection methods: Comparison of bovine whole blood assay (bWBA) and monocyte activation test (MAT). BMC Pharmacol Toxicol. 2014;15:50. https://doi.org/10.1186/2050-6511-15-50Hartung T, Wendel A. Detection of Pyrogens using human whole blood. ALTEX. 1995;12(2):70–5. PMID: 11178418.Ziegler‐Heitbroc H, Thiel E, Futterer A, Herzog V, Wirtz A, Riethmüller G. Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristics of mature monocytes. Int J Cancer. 1988;41(3):456–61. https://doi.org/10.1002/ijc.2910410324Wunderlich C, Schumacher S, Kietzmann M. Pyrogen detection methods: Comparison of bovine whole blood assay (bWBA) and monocyte activation test (MAT). BMC Pharmacol Toxicol. 2014;15:50. https://doi.org/10.1186/2050-6511-15-50Akula S, Lara S, Olsson A-K, Hellman L. Quantitative analysis of the transcriptome of two commonly used human monocytic cell lines – THP-1 and Mono Mac 6 – Reveals their arrest during early monocyte/neutrophil differentiation. Int J Mol Sci. 2022;23(10):5818. https://doi.org/10.3390/ijms23105818Ziegler‐Heitbroc H, Thiel E, Futterer A, Herzog V, Wirtz A, Riethmüller G. Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristics of mature monocytes. Int J Cancer. 1988;41(3):456–61. https://doi.org/10.1002/ijc.2910410324Moesby L, Hansen EW, Christensen JD. Ultrasonication of pyrogenic microorganisms improves the detection of pyrogens in the Mono Mac 6 assay. Eur J Pharm Sci. 2000;11(1):51–7. https://doi.org/10.1016/S0928-0987(00)00080-4Akula S, Lara S, Olsson A-K, Hellman L. Quantitative analysis of the transcriptome of two commonly used human monocytic cell lines – THP-1 and Mono Mac 6 – Reveals their arrest during early monocyte/neutrophil differentiation. Int J Mol Sci. 2022;23(10):5818. https://doi.org/10.3390/ijms23105818Тюкавкина СЮ, Лабушкина АВ, Оксенюк ОС. Роль toll-подобных рецепторов в иммунопатогенезе нефропатий. Журнал фундаментальной медицины и биологии. 2017;(1):17–26.Moesby L, Hansen EW, Christensen JD. Ultrasonication of pyrogenic microorganisms improves the detection of pyrogens in the Mono Mac 6 assay. Eur J Pharm Sci. 2000;11(1):51–7. https://doi.org/10.1016/S0928-0987(00)00080-4Koryakina A, Frey E, Bruegger P. Cryopreservation of human monocytes for pharmacopeial monocyte activation test. J Immunol Methods. 2014;405:181–91. https://doi.org/10.1016/j.jim.2014.01.005Tyukavkina SYu, Labushkina AV, Oksenyuk OS. The role of toll-like receptors in the immunopathogenesis of the nephropathies with fibrosis. Journal of Fundamental Medicine and Biology. 2017;(1):17–26. EDN: ZSIYPJKim JH, Jung K, Kim J, Lee J, Kim H, Song H, et al. Development of a rabbit monocyte activation test as an alternative to the rabbit pyrogen test and its application in the analysis of plasma-derived products. Biologicals. 2021;71:20–30. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2021.04.003Koryakina A, Frey E, Bruegger P. Cryopreservation of human monocytes for pharmacopeial monocyte activation test. J Immunol Methods. 2014;405:181–91. https://doi.org/10.1016/j.jim.2014.01.005Perdomo-Morales R, Pardo-Ruiz Z, Spreitzer I, Lagarto A, Montag T. Monocyte activation test (MAT) reliably detects pyrogens in parenteral formulations of human serum albumin. ALTEX. 2011;28(3):227–35. https://doi.org/10.14573/altex.2011.3.227Kim JH, Jung K, Kim J, Lee J, Kim H, Song H, et al. Development of a rabbit monocyte activation test as an alternative to the rabbit pyrogen test and its application in the analysis of plasma-derived products. Biologicals. 2021;71:20–30. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2021.04.003Xu X, Xu H, Shang Y, Zhu R, Hong X, Song Z, Yang Z. Development of the general chapters of the Chinese Pharmacopoeia 2020 edition: A review. J Pharm Anal. 2021;11(4):398–404. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2021.05Perdomo-Morales R, Pardo-Ruiz Z, Spreitzer I, Lagarto A, Montag T. Monocyte activation test (MAT) reliably detects pyrogens in parenteral formulations of human serum albumin. ALTEX. 2011;28(3):227–35. https://doi.org/10.14573/altex.2011.3.227Cirefice G, Schütte K, Spreitzer I, Charton E, Shaid S, Viviani L, et al. Rubbrecht. The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report, Biologicals. 2023;84:101702. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2023.101702Xu X, Xu H, Shang Y, Zhu R, Hong X, Song Z, Yang Z. Development of the general chapters of the Chinese Pharmacopoeia 2020 edition: A review. J Pharm Anal. 2021;11(4):398–404. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2021.05Cirefice G, Schütte K, Spreitzer I, Charton E, Shaid S, Viviani L, et al. Rubbrecht. The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report, Biologicals. 2023;84:101702. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2023.101702Cirefice G, Schütte K, Spreitzer I, Charton E, Shaid S, Viviani L, et al. Rubbrecht. The future of pyrogenicity testing: Phasing out the rabbit pyrogen test. A meeting report, Biologicals. 2023;84:101702. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2023.101702

The authors declare that there are no conflicts of interest present.