Вернер Анна Олеговна
ул. Лесопарковая, д. 4, Санкт-Петербург, 195043
Anna O. Verner
4 Lesoparkovaya St., Saint Petersburg 195043
Устинова Татьяна Михайловна, канд. биол. наук
ул. Лесопарковая, д. 4, Санкт-Петербург, 195043
Tatiana M. Ustinova, Cand. Sci. (Biol.)
4 Lesoparkovaya St., Saint Petersburg 195043
Венгерович Николай Григорьевич, д-р мед. наук, доцент
ул. Лесопарковая, д. 4, Санкт-Петербург, 195043
Nikolai G. Vengerovich, Dr. Sci. (Med.), Associate Professor
4 Lesoparkovaya St., Saint Petersburg 195043
ВВЕДЕНИЕ. Для определения мутагенности лекарственных средств используется метафазный анализ, точность теста напрямую зависит от качества приготовленных цитогенетических препаратов. Возможная артефактная потеря хромосом, приводящая к ошибкам при трактовке результатов, длительность и трудоемкость пробоподготовки обусловливают необходимость совершенствования существующих методик подготовки цитогенетических препаратов.
ЦЕЛЬ. Оптимизация методики приготовления цитогенетических препаратов клеток костного мозга млекопитающих in vivo для метафазного анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Исследования выполнены на беспородных мышах-самцах массой 18–20 г. Пробоподготовку цитогенетических препаратов костного мозга выполняли по оригинальным и адаптированным методикам «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» под ред. Миронова А.Н. (2012 г.) и ГОСТ 34659-2020 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Оценка хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих». Для приготовления препаратов использовали раствор Хенкса, растворы цитрата натрия и хлорида калия, уксусную кислоту, метиловый спирт, среду 199, буферный раствор HEPES и краситель Гимзы.
РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведен сравнительный экспериментальный анализ характеристик цитогенетических препаратов для проведения метафазного анализа клеток костного мозга млекопитающих in vivo, подготовленных по различным методикам. Выявлено, что препараты, полученные по методике «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств», характеризовались максимальной долей доступных для анализа пластинок по сравнению с препаратами, полученными другими способами пробоподготовки. Оптимизированы условия пробоподготовки, в том числе состав гипотонического раствора (0,56% раствора KCl), время гипотонической обработки (20 мин) и фиксации (12 ч), состав культуральной среды (среда 199 жидкая с солями Хенкса с глутамином), введена стадия префиксации хромосом 6%-ным раствором уксусной кислоты, что в целом способствовало увеличению доли доступных для анализа метафазных пластинок путем снижения разброса и слипания хромосом.
ВЫВОДЫ. Предложена методика приготовления цитогенетических препаратов, позволяющая увеличить долю доступных метафазных пластинок для анализа до 56%, долю хромосом с полным набором (n=40) на 12% и сократить время приготовления образцов на 2–10 ч по сравнению с использовавшимися ранее методиками.
INTRODUCTION. Metaphase analysis is used to assess the mutagenicity of medicines, and its accuracy depends directly on the quality of cytogenetic preparations. Existing procedures for cytogenetic sample preparation require optimisation because of their time and labour intensiveness and potential for artefactual chromosome loss that leads to errors in the interpretation of analytical results.
AIM. This study aimed to optimise a cytogenetic sample preparation procedure for mammalian bone marrow cells for in vivo metaphase analysis.
MATERIALS AND METHODS. The study was performed in randomly bred male mice weighing 18–20 g. The authors prepared cytogenetic samples of bone marrow cells according to the procedures set forth in the Guidelines for Conducting Preclinical Studies of Drugs (A.N. Mironov (ed.), 2012), and GOST 34659-2020, Methods for Testing the Impact of Chemical Products on the Human Body. Assessment of Chromosomal Aberrations in Bone Marrow Cells of Mammals, as described and with modifications. Sample preparation involved using Hanks’ solution, sodium citrate and potassium chloride solutions, acetic acid, methyl alcohol, medium 199, HEPES, and Giemsa stain.
RESULTS. The authors conducted an experimental comparison of the characteristics of cytogenetic preparations of mammalian bone marrow cells for in vivo metaphase analysis prepared using several methods. The samples prepared in accordance with the Guidelines for Conducting Preclinical Studies of Drugs exhibited the highest percentage of analysable metaphase plates, in comparison with those obtained using the other sample preparation procedures. The authors optimised the sample prepara tion conditions, including the composition of the hypotonic solution (0.56% KCl), the time of hypotonic treatment (20 min), the time of fixation (12 h), and the composition of the culture medium (liquid medium 199 with Hanks’ salts and glutamine). The authors introduced a step of preliminary chromosome fixation with 6% acetic acid, which generally contributed to an increase in the proportion of analysable metaphase plates by reducing the scattering and sticking of chromosomes.
CONCLUSIONS. The authors presented a modified sample preparation procedure for cytogenetic preparations that, compared with the previous procedures, offers an increase in the percentage of analysable metaphase plates to 56%, a 12% rise in the percentage of full sets of chromosomes (n=40), and a 2–10-hour reduction in the preparation time.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.