vedomostiregmedРегуляторные исследования и экспертиза лекарственных средствRegulatory Research and Medicine Evaluation3034-30623034-3453Federal State Budgetary Institution ‘Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products’ of the Ministry of Health of the Russian Federation (FSBI ‘SCEEMP’)10.30895/1991-2919-2022-387vedomostiregmed-466Research ArticleМЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯTESTING PROCEDURESИнгибиторы нейраминидазы: разработка и валидация методики определения ингибирующего действия in vitroNeuraminidase Inhibitors: Development and Validation of a Procedure for In Vitro Determination of the Inhibitory Effecthttps://orcid.org/0000-0002-6866-5741ФаустоваН. М.FaustovaN. M.

Фаустова Наталья Михайловна - кандидат химических наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663

Natalia M. Faustova - Cand. Sci. (Chem.).

3/245 Zavodskaya St., Kuzmolovsky urban-type settlement, Vsevolozhsky district, Leningrad region 188663

faustova.nm@doclinika.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4735-3079ПетлицкаяС. С.PetlitskayaS. S.

Петлицкая Серафима Сергеевна.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663

Seraphima S. Petlitskaya.

3/245 Zavodskaya St., Kuzmolovsky urban-type settlement, Vsevolozhsky district, Leningrad region 188663

petlitskaya.ss@doclinika.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0833-3371АмпилоговаИ. Н.AmpilogovaI. N.

Ампилогова Ирина Николаевна - кандидат химических наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663

Irina N. Ampilogova - Cand. Sci. (Chem.).

3/245 Zavodskaya St., Kuzmolovsky urban-type settlement, Vsevolozhsky district, Leningrad region 188663

ampilogova.in@doclinika.ruhttps://orcid.org/0000-0002-6292-8934КарлинаМ. В.KarlinaM. V.

Карлина Марина Валерьевна - кандидат биологических наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663

Marina V. Karlina - Cand. Sci. (Biol.).

3/245 Zavodskaya St., Kuzmolovsky urban-type settlement, Vsevolozhsky district, Leningrad region 188663

karlina.mv@doclinika.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3176-6386МакароваМ. Н.MakarovaM. N.

Макарова Марина Николаевна - доктор медицинских наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663

Marina N. Makarova - Dr. Sci (Med.).

3/245 Zavodskaya St., Kuzmolovsky urban-type settlement,  Vsevolozhsky district, Leningrad region 188663

makarova.mn@doclinika.ruhttps://orcid.org/0000-0002-2447-7888МакаровВ. Г.MakarovV. G.

Макаров Валерий Геннадьевич - доктор медицинских наук.

Заводская ул., д. 3, к. 245, г.п. Кузьмоловский, Всеволожский р-н, Ленинградская обл., 188663

Valery G. Makarov - Dr. Sci (Med.).

3/245 Zavodskaya St., Kuzmolovsky urban-type settlement, Vsevolozhsky district, Leningrad region 188663

makarov.vg@doclinika.ruСанкт-Петербургский институт фармацииРоссияSt.-Petersburg Institute of PharmacyRussian FederationАкционерное общество «Научно-производственное объединение «ДОМ ФАРМАЦИИ»РоссияJoint Stock Company “Scientific and Production Association HOME OF PHARMACY”Russian Federation2023240320231316076Copyright © Фаустова Н.М., Петлицкая С.С., Ампилогова И.Н., Карлина М.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г., 20232023Фаустова Н.М., Петлицкая С.С., Ампилогова И.Н., Карлина М.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г.Faustova N.M., Petlitskaya S.S., Ampilogova I.N., Karlina M.V., Makarova M.N., Makarov V.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.vedomostincesmp.ru/jour/article/view/466

Ингибиторы нейраминидазы — класс препаратов, применяемый для лечения инфекции, вызываемой вирусами гриппа. Для скрининга потенциальных ингибиторов  нейраминидазы  представляет  интерес  разработка  in  vitro  методик без использования вирусов в реакции. Цель работы: разработать  и  валидировать  методику  определения  ингибирующего   действия  веществ  по   отношению к ферменту нейраминидаза (КФ 3.2.1.18) с использованием флуоресцентного субстрата 2’-4(4-метилумбеллиферил)-α-D-N-ацетилнейраминовой кислоты (4MU-NANA) in vitro на примере хиноидных пигментов — потенциальных ингибиторов нейраминидазы. Материалы и методы: в основе метода лежит ферментативное  расщепление  субстрата   4MU-NANA   ферментом   нейраминидазой с образованием флуоресцентного маркера 4-метилумбеллиферона с детекцией при длинах волн возбуждения/испускания 360/450 нм. Результаты: методика валидирована по параметрам: специфичность, линейность, точность, прецизионность. Линейность методики составила 0,31–80  мкМ  4-метилумбеллиферона. Точность для четырех уровней концентраций, включая нижний предел количественного определения, находилась в пределах 87–114%, т.е. относительная погрешность при оценке точности не превышала 15%. Внутридневная прецизионность составила 1,5–10,4%, междневная прецизионность 2,3–9,6%. При оценке ингибирующего действия на примере занамивира гидрата (0,6–150 нМ) точность составила 89–120%, прецизионность 3,1–11,0%. Для контрольных образцов занамивира гидрата значение IC50 составило 27 ± 3 нМ,  для  осельтамивира IC50 = 16 ± 2 нМ. Для тестирования субстанций допустимо использовать растворители: диметилсульфоксид 50%,  полисорбата 80  раствор 5%,  этанол 50% и метанол 50 и 100%. Для соединений, нерастворимых в перечисленных растворителях, предложено получение комплексов включения с 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином. Для исследуемого вещества биснафтазарина, хиноидного пигмента природного происхождения, IC50 составила 273 ± 28 нМ. Заключение: методика характеризуется удовлетворительной точностью и воспроизводимостью и может быть использована для скрининга потенциальных ингибиторов нейраминидазы. Для тестирования нерастворимых веществ предложено их применение в виде комплексов включения с циклодекстринами.

Neuraminidase inhibitors are a class of antivirals used to  treat  influenza  infections. Screening assays for potential neuraminidase inhibitors would benefit from  the development of in vitro procedures that do not require handling viruses. The aim of the study was to  develop  and  validate  a  procedure  for  in  vitro  determination of inhibitory effects on neuraminidase (EC 3.2.1.18), using 2’-4(methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid (4MU-NANA) as a fluorogenic substrate and quinonoid pigments, potential neuraminidase inhibitors, as a case study. Materials and methods: the method is based on neuraminidase cleavage of 4MU-NANA   to release fluorescent 4-methylumbelliferone, which is detected at the excitation  and emission wavelengths of 360 and 450 nm, respectively. Results: the procedure was validated for specificity, range, accuracy, and precision. It remained linear over the range of 0.31–80 μM of 4-methylumbelliferone. The accuracy for four concentration levels (including the LLOQ) was 87–114%; i.e., the relative error of accuracy evaluation was less than 15%. The intra- and inter-day precision ranged from 1.5 to 10.4% and from 2.3 to 9.6%, respectively. Inhibitory effect evaluation using zanamivir hydrate (0.6–150 nM) demonstrated the accuracy of 89–120% and the precision  of 3.1–11.0%. The IC50 values for positive controls (zanamivir hydrate and oseltamivir) were 27 ± 3 and 16 ± 2 nM, respectively. The following solvents may be used: 50% dimethyl sulfoxide, 5% Polysorbate 80, 50% ethanol, 50 and 100% methanol. If  a compound is insoluble in the solvents, it is possible to form inclusion complexes with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin. For bisnaphthazarin, the natural quinonoid pigment used in the study, the IC50 amounted to 273 ± 28 nМ. Conclusion: the procedure demonstrated adequate accuracy and reproducibility and is recommended  for screening for potential neuraminidase inhibitors. In order to use the procedure for insoluble substances, the authors suggest forming inclusion complexes with cyclodextrins.

нейраминидазаосельтамивирзанамивира гидратингибирующее действие2-гидроксипропил-β-циклодекстринбиснафтазаринneuraminidaseoseltamivirzanamivir hydrateinhibitory effect2-hydroxypropyl-β-cyclodextrinbisnaphthazarinАвторы выражают признательность и благодарность ст. научн. сотруднику Ю.В. Дадали (ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации») за получение и предоставление для тестирования 1% комплекса биснафтазарина с 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином.The authors are grateful to Yu.V. Dadali (St.-Petersburg Institute of Pharmacy) for obtaining and providing 1% complex of bisnaphthazarin with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin for testing.ReferencesЛусс ЛВ. Современные принципы диагностики и терапии гриппа. Русский медицинский журнал. 2007;(5):407.Luss LV. Modern principles of diagnosis and therapy of influenza. Russkiy meditsinskiy zhurnal = Russian Medical Journal. 2007;(5):407 (In Russ.)Митрофанова ВН, Мельников ВЛ, Юрина НВ, Бурко ПА. Сравнительный анализ клинико-эпидемиологических особенностей течения гриппа А (H1N1/2009) в период эпидемиологического подъема заболеваемости. Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2010;15(3):74–5.Mitrofanova VN, Mel’nikov VL, Yurina NV, Burko PA. Comparative analysis of clinical and epidemiological features of influenza A (H1N1/2009) during the epidemic rise in cases. Izvestiya vysshikh uchebnykh zavedeniy. Povolzhskiy region. Meditsinskie nauki. = University Proceedings. Volga Region. Medical Sciences. 2010;15(3):74–5 (In Russ.)Якимов СС. Рациональный подход к комплексной терапии гриппа. Медицинский совет. 2013;1– 2:26–31.Yakimov SS. Rational approach to complex treatment of influenza. Meditsinskiy sovet = Medical Council. 2013;1–2:26–31 (In Russ.)Филдс Б, Найп Д, ред. Вирусология. Т. 2. М.: Мир; 1989.Fields B, Knipe D, eds. Virology. V. 2. Moscow: Mir; 1989 (In Russ.)Ohuchi M, Feldmann A, Ohuchi R, Klenk HD. Neuraminidase is essential for fowl plague virus hemagglutinin to show hemagglutinating activity. Virology. 1995;212(1):77–83. https://doi.org/10.1006/viro.1995Ohuchi M, Feldmann A, Ohuchi R, Klenk HD. Neuraminidase is essential for fowl plague virus hemagglutinin to show hemagglutinating activity. Virology. 1995;212(1):77–83. https://doi.org/10.1006/viro.1995Jagadesh A, Salam AA, Madgal PP, Arunkumar G. Influenza virus neuraminidase (NA): a target for antivirals and vaccines. Arch Virol. 2016;161(8):2087–94. https://doi.org/10.1007/s00705-016-2907-7Jagadesh A, Salam AA, Madgal PP, Arunkumar G. Influenza virus neuraminidase (NA): a target for antivirals and vaccines. Arch Virol. 2016;161(8):2087–94. https://doi.org/10.1007/s00705-016-2907-7Штыря ЮА, Мочалова ЛВ, Бовин НВ. Нейраминидаза вируса гриппа: структура и функция. Acta Naturae. 2009;1(2):28–34. https://doi.org/10.32607/20758251-2009-1-2-26-32Shtyrya YA, Mochalova LV, Bovin NV. Influenza virus neuraminidase: structure and function. Acta Naturae. 2009;1(2):28–34 https://doi.org/10.32607/20758251-2009-1-2-26-32Jeong HJ, Ryu YB, Park SJ, Kim JH, Kwon HJ, Kim JH, at al. Neuraminidase inhibitory activities of flavonols isolated from Rhodiola rosea roots and their in vitro anti-influenza viral activities. Bioorg Med Chem. 2009;17(19):6816–23. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2009.08.036Jeong HJ, Ryu YB, Park SJ, Kim JH, Kwon HJ, Kim JH, at al. Neuraminidase inhibitory activities of flavonols isolated from Rhodiola rosea roots and their in vitro anti-influenza viral activities. Bioorg Med Chem. 2009;17(19):6816–23. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2009.08.036Sharshov KA, Yurlov AK, Li X, Wang W, Li L, Bi Yu, et al. Avian influenza virus ecology in wild birds of Western Siberia. Avian Res. 2017;8(12):1–5. https://doi.org/10.1186/s40657-017-0070-9Sharshov KA, Yurlov AK, Li X, Wang W, Li L, Bi Yu, et al. Avian influenza virus ecology in wild birds of Western Siberia. Avian Res. 2017;8(12):1–5. https://doi.org/10.1186/s40657-017-0070-9Buxton RC, Edwards B, Juo RR, Voyta JC, Tisdale M, Bethell RC. Development of a sensitive chemiluminescent neuraminidase assay for the determination of influenza virus susceptibility to zanamivir. Anal Biochem. 2000;280(2):291–300. https://doi.org/10.1006/abio.2000.4517Buxton RC, Edwards B, Juo RR, Voyta JC, Tisdale M, Bethell RC. Development of a sensitive chemiluminescent neuraminidase assay for the determination of influenza virus susceptibility to zanamivir. Anal Biochem. 2000;280(2):291–300. https://doi.org/10.1006/abio.2000.4517Potier M, Mameli L, Belisle M, Dallaire L, Melancon SB. Fluorometric assay with a sodium (4 -methylumbellifer yl-α-D-N-acetylneuraminate) substrate. Anal Biochem. 1979;94(2):287–96. https://doi.org/10.1016/0003-2697(79)90362-2Potier M, Mameli L, Belisle M, Dallaire L, Melancon SB. Fluorometric assay with a sodium (4 -methylumbellifer yl-α-D-N-acetylneuraminate) substrate. Anal Biochem. 1979;94(2):287–96. https://doi.org/10.1016/0003-2697(79)90362-2Engstler M, Talhouk JW, Smith RE, Shauner R. Chemical synthesis of 4-trifluoromethylumbelliferyl-α-D-N-acetylneuraminic acid glycoside and its use for the fluorometric detection of poorly expressed natural and recombinant sialidases. Anal Biochem. 1997;250(2):176– 80. https://doi.org/10.1006/abio.1997.2205Engstler M, Talhouk JW, Smith RE, Shauner R. Chemical synthesis of 4-trifluoromethylumbelliferyl-α-D-N-acetylneuraminic acid glycoside and its use for the fluorometric detection of poorly expressed natural and recombinant sialidases. Anal Biochem. 1997;250(2):176– 80. https://doi.org/10.1006/abio.1997.2205Leang SК, Hurt AC. Fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals. J Vis Exp. 2017;(122):55570. https://doi.org/10.3791/55570Leang SК, Hurt AC. Fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals. J Vis Exp. 2017;(122):55570. https://doi.org/10.3791/55570Wetherall NT, Trivedi T, Zeller J, Hodges-Savola C, McKimm-Breschkin JL, Zambon M, Hayden FG. Evaluation of neuraminidase enzyme assays using different substrates to measure susceptibility of influenza virus clinical isolates to neuraminidase inhibitors: report of the neuraminidase inhibitor susceptibility network. J Clin Microbiol. 2003;41(2):742–50. https://doi.org/10.1128/JCM.41.2.742-750.2003Wetherall NT, Trivedi T, Zeller J, Hodges-Savola C, McKimm-Breschkin JL, Zambon M, Hayden FG. Evaluation of neuraminidase enzyme assays using different substrates to measure susceptibility of influenza virus clinical isolates to neuraminidase inhibitors: report of the neuraminidase inhibitor susceptibility network. J Clin Microbiol. 2003;41(2):742–50. https://doi.org/10.1128/JCM.41.2.742-750.2003Nishikawa T, Shimizu K, Tanaka T, Kuroda K, Takayama T, Yamamoto T, et al. Bacterial neuraminidase rescues influenza virus replication from inhibition by a neuraminidase inhibitor. PLoS One. 2012;7(9):e45371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045371Nishikawa T, Shimizu K, Tanaka T, Kuroda K, Takayama T, Yamamoto T, et al. Bacterial neuraminidase rescues influenza virus replication from inhibition by a neuraminidase inhibitor. PLoS One. 2012;7(9):e45371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0045371Pozharitskaya ON, Shikov AN, Makarova MN, Ivanova SA, Kosman VM, Makarov VG, et al. Antiallergic effects of pigments isolated from green sea urchin (Strongylocentrotus droebachiensis) shells. Planta Med. 2013;79(18):1698–704. https://doi.org/10.1055/s-0033-1351098Pozharitskaya ON, Shikov AN, Makarova MN, Ivanova SA, Kosman VM, Makarov VG, et al. Antiallergic effects of pigments isolated from green sea urchin (Strongylocentrotus droebachiensis) shells. Planta Med. 2013;79(18):1698–704. https://doi.org/10.1055/s-0033-1351098Никитин НА. Циклодекстрины и их комплексы включения. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2015;(6):3–11.Nikitin NA. Cyclodextrins and their inclusion complexes. Voprosy biologicheskoy, meditsinskoy i farmatsevticheskoy khimii = Problems of Biological, Medical and Pharmaceutical Chemistry. 2015;(6):3–11 (In Russ.)Quosdorf S, Schuetz A, Kolodziej H. Different inhibitory potencies of oseltamivir carboxylate, zanamivir, and several tannins on bacterial and viral neuraminidases as assessed in a cell-free fluorescence-based enzyme inhibition assay. Molecules. 2017;22(11):1989. https://doi.org/10.3390/molecules22111989Quosdorf S, Schuetz A, Kolodziej H. Different inhibitory potencies of oseltamivir carboxylate, zanamivir, and several tannins on bacterial and viral neuraminidases as assessed in a cell-free fluorescence-based enzyme inhibition assay. Molecules. 2017;22(11):1989. https://doi.org/10.3390/molecules22111989

The authors declare that there are no conflicts of interest present.