Транова Юлия Сергеевна.
ул. Высоковольтная, д. 9, Рязань, 390026
Yuliya S. Tranova.
9 Vysokovoltnaya St., Ryazan 390026
Щулькин Алексей Владимирович - доктор медицинских наук, доцент.
ул. Высоковольтная, д. 9, Рязань, 390026
Aleksey V. Shchulkin - Dr. Sci. (Med.), Associate Professor.
9 Vysokovoltnaya St., Ryazan 390026
Черных Иван Владимирович - кандидат биологических наук, доцент.
ул. Высоковольтная, д. 9, Рязань, 390026
Ivan V. Chernykh - Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor.
9 Vysokovoltnaya St., Ryazan 390026
Мыльников Павел Юрьевич.
ул. Высоковольтная, д. 9, Рязань, 390026
Pavel Yu. Mylnikov.
9 Vysokovoltnaya St., Ryazan 390026
Слепнев Александр Александрович - кандидат биологических наук, доцент.
ул. Высоковольтная, д. 9, Рязань, 390026
Aleksandr A. Slepnev - Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor.
9 Vysokovoltnaya St., Ryazan 390026
Якушева Елена Николаевна - доктор медицинских наук, профессор.
ул. Высоковольтная, д. 9, Рязань, 390026
Elena N. Yakusheva - Dr. Sci. (Med.), Professor.
9 Vysokovoltnaya St., Ryazan 390026
Митоксантрон — маркерный субстрат белка устойчивости рака молочной железы (BCRP), участвующего в ряде фармакокинетических межлекарственных взаимодействий. При проведении исследований in vitro в связи с возможной насыщаемостью транспортера BCRP целесообразно применять невысокие концентрации митоксантрона, поэтому необходим высокочувствительный метод его количественного определения.
Цель работы: разработка и валидация методики количественного определения митоксантрона в среде для культивирования клеток Caco-2 методом ВЭЖХ-МС/МС.
Материалы и методы: анализ выполняли на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Ultimate 3000» (Thermo Fisher Scientific) с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором TSQ Fortis и колонкой UCT Selectra C18 4,6×100 мм, 5 мкм, 100 Å. Использовали градиентный режим элюирования, подвижная фаза — смесь раствора муравьиной кислоты 1% и метанола. Скорость подвижной фазы — 0,3 мл/мин, температура разделения — 35 °С, объем пробы — 5 мкл. Длительность анализа — 10 мин, время удерживания митоксантрона — 5,51 мин. Пробоподготовка заключалась в осаждении белка среды для культивирования метанолом и центрифугировании (13000 g, 10 мин). Детектирование проводили в режиме регистрации положительных ионов, метод ионизации — электрораспыление (3700 В), оболочечный газ 50 л/мин, вспомогательный газ 10 л/мин, продувочный газ 1 л/мин, температура трубки для переноса ионов 300 °С, температура испарителя 350 °С. Переходы масс: 455 m/z → 88,2 m/z при энергии столкновения 25 В, 455 m/z → 358,1 m/z при 18 В, фрагментация источника 0, CID gas 2 мТорр.
Результаты: методика характеризовалась селективностью, чувствительностью (предел обнаружения — 10 нмоль/л, нижний предел количественного определения — 50 нмоль/л), правильностью, прецизионностью и линейностью (50−1000 нмоль/л). Отсутствовал перенос пробы и матричный эффект, образцы проб обладали стабильностью при моделировании реальных условий хранения. Методика позволяет проводить доклинические исследования влияния лекарственных веществ на активность BCRP путем оценки трансцеллюлярного переноса митоксантрона в присутствии тестируемого вещества.
Выводы: разработана и валидирована ВЭЖХ-МС/МС методика количественного анализа митоксантрона в среде для культивирования клеток Caco-2.
Mitoxantrone is a marker substrate of breast cancer resistance protein (BCRP). BCRP is involved in a number of pharmacokinetic drug-drug interactions. The transporter’s possible saturability makes it advisable to use low concentrations of mitoxantrone for in vitro studies. Consequently, mitoxantrone quantification requires a method with high sensitivity.
The aim of the study was to develop and validate a procedure for mitoxantrone quantification in Caco-2 culture media by HPLC-MS/MS.
Materials and methods. The authors used an Ultimate 3000 HPLC system and a TSQ Fortis triple quadrupole mass spectrometer by Thermo Fisher Scientific and a Selectra C18 column (4.6×100 mm, 5 μm, 100 Å) by United Chemical Technologies. The elution ran in a gradient mode with a mobile phase of 1% formic acid solution and methanol. Experimental parameters were as follows: eluent flow rate, 0.3 mL/min; separation column temperature, 35 °C; injection volume, 5 μL; ana lysis time, 10 min; approximate mitoxantrone retention time, 5.51 min. The sample preparation involved protein precipitation from the culture medium with methanol, followed by centrifugation at 13,000 g for 10 min. The detection was performed using electrospray ionisation in the positive ion mode. Detection parameters were as follows: electrospray voltage, 3700 V; sheath gas flow rate, 50 L/min; auxiliary gas flow rate, 10 L/min; sweep gas flow rate, 1 L/min; ion-transfer tube temperature, 300 °C; and evaporator temperature, 350 °C. The detection was set at mass transitions of m/z 455 to 88.2 and m/z 455 to 358.1, with the collision energy for these transitions amounting to 25 V and 18 V, respectively. The source fragmentation was at 0, and the CID gas pressure was at 2 mTorr.
Results. The analytical procedure showed selectivity, high sensitivity (limit of detection, 10 nmol/L; lower limit of quantification, 50 nmol/L), accuracy, precision, and linearity in the concentration range of 50–1000 nmol/L. The authors observed no carryover or matrix effects. A simulation of real-life storage conditions demonstrated high stability of mitoxantrone samples. Thus, the analytical procedure enables preclinical evaluation of medicinal product effects on the functional activity of BCRP, based on assessing the transcellular mitoxantrone transport in the presence of a test product.
Conclusion. The authors developed and validated the analytical procedure for mitoxantrone quantification in Caco-2 culture media by HPLC-MS/MS.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.